Akai QX-3700 User Manual download pdf (Page 89)

miało być dokonanie w 3 lata, czyli do 2001 roku

tego, co Projekt Badawczy — Genom Człowieka

HGP przewidywał początkowo na rok 2005 — po

znanie sekwencji zasad w ludzkim genomie. Nazwa

Celera, bo tak została nazwana firma, pochodzi od

angielskiego słowa celerity, które w wolnym tłuma

czeniu znaczy szybkość. Właśnie szybkość prowa

dzenia przez tę firmę badań jest jej głównym atutem.

Według szefów firmy nowatorskie podejście do se

kwencjonowania genomu, opierające się na meto

dzie „

shotgun” (objaśnionej w kolejnym rozdziale),

jak i 300 w pełni automatycznych sekwenatorów

PRISM 3700 firmy Perkin Elmer [27], które połączo

ne są z najpotężniejszym ze stosowanych, cywilnym

komputerem, ma przyczynić się do światowej domi

nacji w przedsięwzięciu badania sekwencji geno

mów organizmów wyższych, a w szczególności ge

nomu człowieka. Każdy z tych sekwenatorów zawie

ra 96 kapilar, a wydajność wszystkich 300 szacowa

na jest na ponad 100 milionów odczytanych zasad

dziennie. Komputer, który stworzyła firma Compaq

ma gigantyczną moc obliczeniową — 1,3 tryliona

operacji na sekundę.

III—1. Strategia sekwencjonowania

Strategia, stosowana przez tę firmę polega na se

kwencjonowaniu losowych klonów pokrywających

cały ludzki genom (ang.

whole-genome shotgun

sequencing) [28]. Głównym jej założeniem jest se-

kwencjonowanie ludzkiego DNA jako całości, bez

wstępnej selekcji fragmentów, w przeciwieństwie do

strategii przyjętej w HGP, w której do analiz wybiera

się konkretne odcinki genomu (patrz rozdział II-1).

Inną istotną różnicą w stosunku do strategii stosowa

nej przez HGP jest klonowanie pofragmentowanego

DNA bezpośrednio do wektorów sekwencyjnych.

(Ryc. Ib)

Tę strategię badawczą, jako alternatywną i tańszą,

zaproponowali w 1997 roku Projektowi Badawcze

m u — Genom Człowieka, J a m e s

Weber i Eu

gene Mayers (obecnie zatrudniony w firmie Ce

lera) [28]. Spotkała się ona jednak z ostrą krytyką

[29] ze strony badaczy zaangażowanych, w rozwija

nie pierwotnie przyjętej strategii sekwencjonowania

(rozdział II-1). Sugerowali oni, że z powodu wielu

przerw w uzyskanej sekwencji doprowadzenie jej do

postaci kompletnej będzie bardzo kosztowne, a całe

przedsięwzięcie niezwykle ryzykowne.

Etapy uzyskiwania sekwencji w strategii „shot

gun”:

1. Fizyczna fragmentacja całego genomowego

DNA na krótkie odcinki o długości około 2 kpz,

oraz niezależna fragmentacja na odcinki dłuższe

około 10 kpz. Autonomiczne pozyskiwanie frag

mentów o długości około 150 kpz. (metodę opi

sano w rozdziale II-1.1.)

2. Wklonowanie fragmentów ~2 kpz i -10 kpz do

wektorów plazmidowych pochodnych pUC, od

powiednio o wysokim i o niskim współczynniku

replikacji. Klony z krótszymi insertami stanowią

większość matryc do sekwencjonowania, pod

czas gdy klony z dłuższymi insertami są matryca

mi obejmującymi m.in. elementy repetytywne

np. Line-1. Fragmenty o wielkości około 150 kpz

wklonowywane są do wektorów BAC. Fragmen

ty sekwencji insertów uzyskane z tych klonów,

stanowią „platformę”, na którą nanoszone są se

kwencje insertów uzyskane z klonów pochod

nych pUC. Sekwencje końców BAC pozyskiwa

ne są także z „serwera klonów” HGP [15].

3. Sekwencjonowanie odcinków o długości około

500 pz z obu końców insertu, z losowo wybiera

nych klonów pUC i BAC. Ponieważ sekwencjo-

nowane są tylko końce insertów, a nie całe inser

ty, całkowita długość uzyskanej sekwencji musi

być kilkukrotnym ekwiwalentem jej wyjściowej

długości [10].

4. Analiza uzyskanych wyników przy pomocy spe

cjalistycznego oprogramowania, składającego

fragmenty sekwencji w całość, zainstalowanego

na komputerze Compaą.

5. Identyfikacja i uzupełnianie przerw w uzyskanej

sekwencji. W celu identyfikacji przerw wyko

rzystuje się takie techniki jak: hybrydyzację

DNA metodą Southerna lub FISH do rozciągnię

tych włókien chromatynowych [13]. W celu ich

uzupełniania stosuje się BLASTX, czyli kompu

terowy algorytm, wykorzystujący końcowe se

kwencje kontigów w wyszukiwaniu „łączników

peptydowych” jak również kroczenie starterami,

których sekwencje także pochodzą z końcowych

elementów kontigów. Na tym etapie, kłopotliwy

dla badacza jest brak uporządkowanych biblio

tek klonów, które w strategii sekwencjonowania

stosowanej przez HGP stanowią punkt odniesie

nia (punkt 3 i 4 w rozdziale II-1). Punktem odnie

sienia dla stosujących metodę „shotgun” jest cały

genomowy DNA.

III-2. Postęp w sekwencjonowaniu genomu

Wybór przez firmę Celera Genomics kontrower

syjnego podejścia [28, 29] do sekwencjonowania

ludzkiego genomu, nie był bezpodstawny. Pierw

szym organizmem, którego genom został całkowicie

POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000

193

http://rcin.org.pl

1 2 ... 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95

Comments to this Manuals

No comments

Akai QX-3700 User Manual Page 89

Comments to this Manuals